Le notizie sulla vita e il martirio di Agnese sono varie e talvolta contrastanti, ma hanno riferimenti antichi, primo fra tutti un carme inciso sulla sua lastra tombale, composto da papa Damaso, morto nel 384, che riporta una fonte orale. Secondo Damaso, Agnese affrontò il rogo con coraggio e con l’atto di coprirsi il corpo nudo con i capelli. L’intrepido coraggio di Agnese, giovanissima eppure matura nella fede, è esaltato da sant’Ambrogio nel De virginibus, nell’inno Agnes beatae virginis e nella lettera a Simpliciano dove la unisce a Tecla e Pelagia, che andarono incontro al martirio come a una festa. Ambrogio, basandosi su tradizioni orali, parla della costrizione a adorare dei pagani, e di un tiranno che la voleva in sposa. Agnese preferì il martirio, e venne trafitta con la spada.

Il poeta cristiano spagnolo Prudenzio celebra Agnese nel XIV inno del Peristephanon (405) introducendo un nuovo elemento: la costrizione a essere esposta in un postribolo. I clienti non osavano guardarla, eccetto un giovane, che non riuscì a possederla a causa di un lampo scagliato da un angelo che lo accecò. La morte, secondo Prudenzio, avvenne per decapitazione. Esistono poi due Passiones (racconti di martirio): una, latina del V secolo, che probabilmente veniva proclamata nella festa di Agnese, e secondo cui il carnefice fu il prefetto di Roma, padre del pretendente respinto: qui si cita il denudamento forzato, il gesto di ricoprirsi e l’avvio di Agnese al postribolo. Nella Passio greca, sempre del V secolo, Agnese è invece una donna adulta che fa conoscere Cristo a molte matrone. Denunciata, viene esposta nel postribolo, da cui però esce illesa, e in seguito martirizzata.

Collazionando le fonti ne escono alcuni dati: Agnese di famiglia romana e cristiana – forse patrizia, ma secondo alcuni figlia di liberti – si consacrò giovanissima a Dio; a dodici anni, durante le persecuzioni di Diocleziano, mentre molti cristiani abiuravano, mantenne la sua fedeltà al Cristo. Il figlio del prefetto di Roma, invaghitosi di lei e respinto, la denunciò alle autorità; forse lo stesso prefetto la fece esporre nuda in un luogo per pubbliche prostitute nel circo Agonale, oggi cripta di Sant’Agnese in piazza Navona. Fu gettata nel fuoco, ma le fiamme si divisero senza lambirla, mentre i capelli le crebbero al punto di ricoprire il corpo nudo. Fu infine trafitta con un colpo di spada alla gola, così come si uccidevano gli agnelli. Anche per questo nell’iconografia è raffigurata spesso con un agnello, simbolo del candore e del sacrificio. Il martirio è stato collocato da alcuni fra 249 e 251 durante la persecuzione decretata dall’imperatore Decio, altri lo pongono nel 304, durante l’ultima grande persecuzione, voluta da Diocleziano. Dopo la sua morte, il corpo fu sepolto nelle catacombe lungo la via Nomentana, oggi conosciute con il suo nome. Qui la principessa Costantina, figlia di Costantino, fece edificare una collegiata col proprio mausoleo. Papa Onorio I, nel VII secolo, fece erigere poi una grandiosa basilica a doppio ordine di colonne, oggetto di ammirazione, impreziosita tra l’altro con un ciclo di affreschi narrante la passio (perduto nei rimaneggiamenti successivi). La basilica fu più volte abbellita, fra Cinquecento e Settecento e rinnovata da Pio IX a metà Ottocento.